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肌浆网内钙容量减少对心肌细胞钙释放的影响

时间:2008-10-11 01:08:48  来源:互联网  作者:
 作者:沈建新,陈耀文,王海燕,韩太真
【关键词】  钙释放
    Regulation of sarcoplasmic reticulum Ca2+ content depletion on cardiac Ca2+ release
  【Abstract】 AIM: To systematically investigate the effects of sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ content depletion on cardiac Ca2+ release. METHODS:  Thapsigargin, a potent SR Ca2+ pump inhibitor, was used to deplete the SR Ca2+ content. The SR Ca2+ content was estimated by traditional caffeine puff. The global Ca2+ release was evoked by local field stimulation and the intracellular Ca2+ signal was recorded by the laser scanning confocal microscope. RESULTS:  The results showed that thapsigargin decreased the SR Ca2+ content in a dosedependent and nonlinear timedependent manner. The intracellular Ca2+ release decreased with the depletion of SR Ca2+. But these two decreases were not parallel to each other. A slight depletion of SR Ca2+ could lead to a significant decrease of Ca2+ release. When SR Ca2+ depleted to a certain degree (though still much higher Ca2+ in SR than in plasma), only little or no Ca2+ release could be triggered by field stimulation. CONCLUSION:  The results suggest that SR Ca2+ content has some important nonlinear regulatory effect on intracellular Ca2+ release.
  【Keywords】 Ca2+ release; microscopy, confocal; sarcoplasmic reticulum; myocardium/cytology
  【摘要】 目的: 较系统地研究肌浆网(SR)内钙容量的减少对心肌细胞钙释放的影响. 方法: 采用肌浆网膜的钙泵抑制剂thapsigargin(TG)耗减SR内钙容量,以喷咖啡因的方法估测SR内钙容量,以局部场刺激的方法诱发全细胞的钙释放. 胞内钙信号的变化均采用激光共聚焦显微镜的方法记录. 结果: SR钙泵抑制剂TG以剂量依赖和非线性的时间依赖方式引致心肌细胞SR内钙容量的耗减,而钙容量的耗减可相应地引起全细胞水平的钙释放减少. 但二者的变化不完全平行,SR内钙容量的少量减少即可引起胞内钙释放的显著减少,而当SR内钙耗减到一定程度后(虽然此时SR内Ca2+仍远高于胞质内钙),场刺激已很难或无法引致钙释放.  结论: 心肌细胞SR内钙容量对胞内钙释放具有重要的非线性调节作用.
 
  【关键词】 钙释放;显微镜检查,共焦;肌浆网;心肌/细胞学
  0引言
  
  在心肌细胞中,胞内钙的大量释放负责启动粗细肌丝的相对滑行,进而导致细胞收缩,是兴奋收缩耦联过程中的关键环节[1]. 钙释放量在很大程度上决定于肌浆网内钙容量的多少[1,2]. 在生理条件下,心肌细胞产生的钙瞬变(calcium transients)中,约有92%的钙来自肌浆网(sarcoplasmic reticulum, SR)[2]. SR内钙增多可提高SR释放钙的敏感性从而增加钙释放量[3]. 但SR钙容量减少对钙释放的影响则未见系统研究. 我们采用肌浆网膜的钙泵抑制剂thapsigargin(TG)耗减SR内钙容量,以喷咖啡因的方法估测SR内钙容量,以局部场刺激的方法诱发全细胞的钙释放,较系统地研究了SR内钙容量减少对心肌细胞钙释放的影响如下.
  1材料和方法
  1.1材料
  心室肌单细胞,取自成年SD大鼠,2~3 mo龄,体质量200~300 g. 采用通用的标准酶解分离技术[4]分离.
  1.2方法
  心肌单细胞与钙荧光指示剂fluo4AM (15  μmol/L)(Molecular Probes, Inc.)共同孵育5 min后以正常胞外液灌流10 min,除去胞外多余的荧光染料并使进入胞内的fluo4AM除去AM基团. 适合进行实验的细胞具有如下特点:  横纹清晰,呈杆状,表面干净平整,无自发收缩[4]. 加载好荧光染料的细胞置于Zeiss LSM410倒置共聚焦显微镜系统的载物台上. 共聚焦显微镜的成像方式为线扫描,采样速率为2.09 ms/线,空间分辨率为0.31 μm/像素. 扫描线位于细胞长轴纵向正中切面的中央(注意避开细胞核). 在有TG存在的情况下,任何一个选定的细胞都只受到一次局部场刺激或被喷一次咖啡因,同时以线扫描的方式记录一幅钙瞬变图像. 所有实验均在室温23~25℃下进行. 在减少SR内钙容量的实验过程中,钙泵抑制thapsigargin(TG, 购自CalbiochemNovabiochem Corp)随细胞外灌流液作用于心肌细胞. 灌流液的成分为(mmol/L): 137 NaCl, 1 CaCl2, 4.9 KCl, 1 MgCl2, 1.2 NaH2PO4, 15 glucose和20 HEPES;pH用NaOH调至7.4[4]. SR内钙容量可通过喷射咖啡因(caffeine puff)的方法估测[5]. 咖啡因(Sigma Corp)浓度为20 mmol/L,喷射时程为500 ms. 喷射装置为一尖端直径约4 μm 的微玻管,其另一端与微量喷射器(Picospritzer, General Valve Co., NJ, USA)相连. 微玻管先置于目标细胞下游约200 μm 处,喷射前则快速移至目标细胞下游100 μm处(Fig 1A). 共聚焦线扫描在喷射咖啡因前200 ms即开始,

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